Dodatkowo, w celu określenia zależności MAF lub niezależności inhibitorów CCND2 zidentyfikowanych podczas wstępnego badania przesiewowego, inhibitory były ponownie testowane w drugorzędowym badaniu przesiewowym, zarówno w obecności, jak i pod nieobecność wektora MAF. W związku z tym nasze badania pierwotne i wtórne mogłyby identyfikować i rozróżniać leki, które powodowały zależną od MAF lub niezależną supresję transkrypcji CCND2 i mogły eliminować leki, które powodowały jedynie pośrednią supresję CCND2 lub LUC wtórną wobec cytotoksyczności 3T3. W zoptymalizowanym i zautomatyzowanym teście komórki reporterowe 3T3 wysiewano na płytki 96-studzienkowe za pomocą robota i traktowano przez 16 godzin w temperaturze 37 ° C związkami o końcowych stężeniach około 5. M z mniej niż 0,1% DMSO. W studzienkach kontrolnych komórki traktowano samym buforem. Przebadano ponad 4000 związków z LOPAC (n = 1,280), Prestwick (n = 1120) i Spectrum (n = 2000). Związki, które indukowały ponad 2-krotne zmniejszenie LUC uzyskanego przez promotor CCND2 względem żywotności, przypisano status przypuszczalnych trafień. Współczynnik wariancji (CV) podczas badania przesiewowego był mniejszy niż 10%. Co zaskakujące, większość trafień z bibliotek LOPAC i Prestwick stanowiły członkowie rodziny glukokortykoidów. Po przebadaniu biblioteki związków Spectrum (rysunek 2A) zidentyfikowaliśmy 38 trafień, z których 29 było również glukokortykosteroidami. Mechanizmy, dzięki którym kortykosteroidy zmniejszają ekspresję genu cykliny D, były przedmiotem równoległych badań i zostały opisane gdzie indziej (12). W szczególności, 9 niesteroidowych związków zidentyfikowano jako domniemane supresory CCND2; obejmowały one rybozyd kinetynowy, kwas dihydrogambowy, monenzynę, patulinę, fiolet gencjanowy, embonian pararosaniliny, pristimerynę, aklawinę i kamptotecynę. Figura 2 Identyfikacja rybozydu kinetyny przez przeszukiwanie biblioteki leków pod kątem inhibitorów aktywacji promotora CCND2 w układzie reporterowym NIH3T3. (A) Związki badano przesiewowo pod kątem hamowania transaktywacji promotora CCND2 po 16 godzinach w modelu reporterowym 3T3, w którym czynnik transaktywujący MAFa. Był koeksprymowany z ekspresją LUC promotora CCND2. Wyniki badania przesiewowego biblioteki Spectrum przedstawiono jako wykres punktowy porównujący pozycję każdego związku (oś x) z jego wpływem na transaktywację promotora CCND2 sterowaną MAF (mierzoną przez LUC) względem wpływu na żywotność 3T3 (mierzoną przez MTS; oś y). Związki poniżej wykropkowanej linii zostały zdefiniowane jako przypuszczalne trafienia. Biblioteki leków LOPAC i Prestwick również poddano badaniom przesiewowym, ale nie pokazano ich. (B) Powtórzyć badanie kinetyny rybozydu (kinetyny R), deksametazonu i nośnika przeciwko komórkom reporterowym eksprymującym LUC kierowanym przez kontrolny promotor RSV lub promotor CCND2, z jednoczesną i bez ekspresji MAF, wykazując, że supresja LUC przez te leki jest mediowana promotor CCND2. Represja aktywności promotora CCND2 przez rybozyd kinetynowy nie jest ograniczona do aktywacji trans indukowanej przez MAF. (C) Tłumienie poziomów białka LUC sterowanego CCND2 w 3T3 po leczeniu rybozydem kinetynowym (10 .M). Wyniki oddzielnych eksperymentów są wykreślane (trójkąty i koła); każdy punkt jest średnią duplikatów. SEM. Ogólna krzywa najlepszego dopasowania jest przedstawiona jako linia ciągła. Pomimo szacowanego okresu półtrwania LUC wynoszącego 3 godziny, rybozyd kinetyny indukuje około 80% supresji w ciągu 9 godzin, co sugeruje, że hamowanie promotora CCND2 rozpoczyna się w ciągu 1. 4 godziny. (D) Struktura chemiczna rybozydu kinetyny. Wykluczenie nieswoistych trafień testowych i ustalanie priorytetów przypuszczalnych inhibitorów transkrypcji CCND2. Leki, które obniżały LUC, ale nie miały żywotności w teście przesiewowym, mogły działać w celu zmniejszenia trans aktywacji promotora cykliny D2 lub alternatywnie mogą bezpośrednio hamować enzym LUC. Aby rozróżnić te możliwości, trafienia testu zostały ponownie przetestowane przeciwko komórkom 3T3, które nadeksprymują LUC pod kontrolą promotora wirusa mięsaka Rousa (RSV). Z tego badania odkryliśmy, że patulina niespecyficznie zmniejszała aktywność LUC, a zarówno patulina, jak i akawelina powodowały nadmierną cytotoksyczność 3T3 (X. Mao i R. Tiedemann, niepublikowane obserwacje). Dlatego leki te zostały wyłączone z dalszej analizy. Jednak inne trafienia, w tym rybozyd kinetynowy (Figura 2B), nie zmniejszyły LUC, gdy były prowadzone przez kontrolny promotor RSV, a zatem działały za pośrednictwem promotora CCND2. Aby skupić się na naszych kolejnych wysiłkach, po raz kolejny wykluczyliśmy związki o doniesieniach o toksyczności, które mogą zapobiegać ogólnoustrojowemu stosowaniu klinicznemu, w tym embonianowi pararosaniliny i fioletowi goryczkowemu (13, 14). Monensyna została również wykluczona po eksperymentach wykazujących nadmierną niespecyficzną toksyczność w stosunku do niezłośliwych komórek hematopoetycznych (R
[podobne: chondropatia rzepki, choroba scheuermanna operacja, chloniak hodgkina ]
Comments are closed.
Nie ufam lekarzom
Article marked with the noticed of: spalanie tłuszczu[…]
poza błonnikiem należy przyjmowac antyoksydanty
[..] Oznaczono ponizsze tresci z artykulu oryginalnego: okulista Pszczyna[…]
korzystnie działaja na zmiejszenie cukru, cholesterolu i wzmocnienie naczyń krwionosnych