Klonalność w ziarniniakowej dominującej limfocytach

Choroba guzkowa dominująca w limfocytach, podtyp choroby Hodgkina, jest leniwym zaburzeniem, w którym nowotwory zawierają odmianę komórek Reeda-Sternberga, znanych jako komórki limfocytowe i histiocytyczne (L & H), które są zmieszane z małymi limfocytami i histiocytami w agregatach guzkowych. 1-4 Badania immunohistochemiczne dostarczyły mocnych dowodów na to, że te komórki L & H pochodzą z komórek B, 5-9, ale to, czy stanowią one populację monoklonalną czy poliklonalną, pozostaje niejasne. Badania przegrupowania immunoglobulin-genu jako markera klonalnego w guzkowej chorobie limfocytu dominującej dały sprzeczne wyniki.10-18 Aby rozwiązać kontrowersje, badacze wyizolowali pojedyncze komórki L & H i badali je przez łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) w celu rearanżacji geny ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, łańcucha lekkiego lub oba.19,20 Küppers i wsp.19 donieśli o klonalnej populacji komórek L & H u pacjenta z guzkową chorobą dominującą w limfocytach, podczas gdy Delabie i wsp. 20 nie wykryli takie populacje u dwóch badanych pacjentów. Nie jest jasne, czy wybór przypadku lub czynniki techniczne, takie jak błąd w doborze próby, uwzględniają te niezgodne ustalenia. Przeprowadziliśmy jednokomórkową analizę pięciu pacjentów z dominującą guzkową chorobą limfocytową; różne guzki w guzie i, jeśli są dostępne, pobrano próbki różnych bloków tkanki i węzłów chłonnych. Znaleźliśmy klonalną populację u każdego z pięciu pacjentów, a w czterech populacja okazała się obecna w całym guzie.
Metody
Wybór sprawy
Przebadaliśmy siedem próbek tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie u pięciu pacjentów z dominującą guzkową chorobą limfocytów, która została wybrana z bazy danych rejestru chłoniaków w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Nebrasce. Wszystkie próbki miały charakterystyczne cechy histopatologiczne i immunofenotyp choroby. Próbki od pacjentów 1, 2, 3 i 4 miały umiarkowanie obfite komórki L & H i stosunkowo niewiele małych limfocytów B w guzkach; w próbce od Pacjenta 5 guzki zawierały niewiele komórek L & H i liczne małe limfocyty B.
Analiza immunohistochemiczna
Skrawki tkanki o grubości od 4 do 6 urn barwiono anty-CD20 lub anty-CD3 (Dako, Carpinteria, CA) za pomocą trzystopniowej metody immunoperoksydazy. 211 Przed barwieniem za pomocą anty-CD20 skrawki ogrzewano w buforze cytrynianowym ( pH 6,0) przez pięć minut w kuchence mikrofalowej; przed barwieniem za pomocą anty-CD3, skrawki trawiono pepsyną.
Izolacja pojedynczych komórek z przekrojów tkankowych
Przy użyciu odwróconego mikroskopu (Nikon, New York) komórki L & H wybarwione anty-CD20 wyizolowano za pomocą mikrowłącza i mikropipety, które zostały przymocowane do mikromanipulatorów hydraulicznych (Narishige, New York) i wypchnięte do probówki zawierającej bufor do PCR jak opisali d Amore i wsp.22. Oprócz komórek L & H, CD20 + małe komórki B i małe limfocyty T CD3 + wyizolowano przez mikromanipulację do stosowania jako kontroli pozytywnej i negatywnej. Sól fizjologiczną buforowaną fosforanem, leżącą nad sekcją, próbkowano okresowo, aby służyć jako kontrola negatywna supernatantu.
Amplifikacja PCR pojedynczych komórek
CDR3 łańcucha ciężkiego każdej pojedynczej komórki amplifikowano po trawieniu proteinazą K za pomocą testowanej PCR z użyciem konsensusowych starterów VH i JH w warunkach gorącego startu. 20,23 Szczegóły tej procedury i jej zastosowania z utrwaloną w formalinie tkanką archiwalną zostały opisane wcześniej.22 Zamplifikowane produkty poddano elektroforezie na 8% żelach poliakrylamidowych i wizualizowano światłem ultrafioletowym po barwieniu bromkiem etydyny.
Sekwencjonowanie DNA
Dla każdego pacjenta reprezentatywne ciężkołańcuchowe produkty PCR CDR3 z komórek, które można zamplifikować, sekwencjonowano w celu określenia ich związku klonalnego
[przypisy: alprazolam, ambrisentan, bikalutamid ]
[patrz też: choroba duhringa, całując się z językiem wymieniasz, deksametazon ]